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慢病毒包裝

 更新時(shí)間:2020-03-19 點(diǎn)擊量:1792

慢病毒(Lentivirus) 載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷Ⅰ型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。所以,在體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究中,慢病毒己經(jīng)成為表達(dá)外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一, 并且正在獲得越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

 

慢病毒(Lentivirus) 載體

 

      在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚無(wú)法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,通過(guò)使用病毒介導(dǎo)的方式能夠大大提高基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,達(dá)到目的基因高效表達(dá)的目的。

 

       具體來(lái)說(shuō),慢病毒包裝主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面:

       1、對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等,能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加,極大地方便了RNAi,cDNA克隆以及報(bào)告基因的研究;

       2、進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選;

       3、為活體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液;

 

慢病毒包裝應(yīng)用

  

       為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,通常需要利用慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝。慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息,慢病毒包裝質(zhì)??商峁┧械霓D(zhuǎn)錄、包裝、重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。離心收集上清液后,可以直接用于宿主細(xì)胞的感染,目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞后,在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為DNA,形成DNA整合前復(fù)合體,進(jìn)入細(xì)胞核后,DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA,回到細(xì)胞漿中,表達(dá)目的蛋白或產(chǎn)生RNAi干擾。

 

慢病毒表達(dá)載體

 

 

       慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)方法

 

 

 

 

 

        1.構(gòu)建含有目的基因的慢病毒表達(dá)載體

        2.細(xì)胞準(zhǔn)備:細(xì)胞傳代后,密度達(dá)到70%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染;

        3.轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備:取兩個(gè)EP管,一個(gè)(A管)加入慢病毒載體的表達(dá)質(zhì)粒、混合包裝質(zhì)粒和Opti-MEMI;另一個(gè)(B管)加入Opti-MEMI、轉(zhuǎn)染試劑,一邊輕柔渦旋A管,一邊往A管滴加B管的溶液。溶液混合后,室溫放置10-25分鐘,即完成轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備。

        4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中,混勻后孵育;

        5.收集病毒:轉(zhuǎn)染后48h、72h收集含慢病毒的上清;

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